51481-10-8/脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的檢測(cè)

背景及概述^[1][2]

嘔吐毒素的主體成分為脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)，主要是由禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)和黃色鐮刀菌(Fusariumculmorum)產(chǎn)生的真菌毒素。1972年，日本的Morooka等人首次從赤霉病大麥中將其分離，Yoshizawa等L2 稍后闡明了它的結(jié)構(gòu)，并將其命名為嘔吐毒素(4deoxynivalenol，DON)。DON在全球范圍內(nèi)廣泛存在，尤其是溫暖潮濕地區(qū)的糧食及其制品中，如美國(guó)、加拿大以及我國(guó)華南等地，歐洲北部和中部的谷物DON檢出率分別高達(dá)70％和66％L5 J，國(guó)內(nèi)形勢(shì)也不容樂觀。

近年來，隨著氣候條件的惡化，DON逐步向北蔓延，在浙江、江蘇、山東、河南等地的檢出率不斷升高。由于其穩(wěn)定的化學(xué)性質(zhì)、較強(qiáng)的熱抵抗力、耐壓、耐酸性，在加工過程中很難被除去，一直成為糧食生產(chǎn)加工過程中的隱患。我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 2762-2011食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中真菌毒素限量中規(guī)定DON限量為≤1000 g/kg，聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織規(guī)定食用糧食中DON的含量<1000 kg。中國(guó)傳統(tǒng)飲食習(xí)慣中糧比例大大高于西方，使得嘔吐毒素的危害更為突出。

結(jié)構(gòu)

性質(zhì)^[1]

DON 的化學(xué)名為32，72，l5一三羥基草鐮孢菌-9-烯-8-酮，CAS：51481-10-8，分子式C₁₅H₂₀O₆，相對(duì)分子量296.32。屬單端孢霉烯族化合物，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定?？膳c核糖體60s亞基的肽轉(zhuǎn)移酶活性中心結(jié)合引發(fā)核糖體應(yīng)激反應(yīng)，抑制DNA、RNA和蛋白的合成，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等作用，對(duì)腸道、免疫系統(tǒng)造成破壞，并且具有遺傳毒性，對(duì)人和動(dòng)物的身體健康具有嚴(yán)重影響，是人畜食品中檢出率和超標(biāo)率最高的一種真菌毒素。DON具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性和免疫抑制性，對(duì)人和動(dòng)物的健康構(gòu)成了嚴(yán)重威脅，歐盟分類標(biāo)準(zhǔn)為三級(jí)致癌物。

危害^[3]

DON是已知的單端孢霉烯族化合物中毒性最強(qiáng)的一種對(duì)人類和動(dòng)物均可造成危害，嚴(yán)重影響人和牲畜的健康。人類攝入了被DON污染的面粉及其制成的食品后，可能會(huì)引起嘔吐、腹瀉、頭疼、頭暈等以消化系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)為主的中毒癥狀，嚴(yán)重時(shí)會(huì)損害造血系統(tǒng)造成死亡。對(duì)于抵抗力較低的老人和兒童，其癥狀表現(xiàn)較為嚴(yán)重。有的病人還有乏力、全身不適，步伐不穩(wěn)等似酒醉樣癥狀，其慢性毒性表現(xiàn)為對(duì)胃癌細(xì)胞有一定的影響。

據(jù)流行病學(xué)調(diào)查表明：動(dòng)物食用DON后，一般表現(xiàn)可引起實(shí)驗(yàn)動(dòng)物食欲下降、體重降低、代謝紊亂等慢性中毒表現(xiàn)，并具有免疫毒性和生殖發(fā)育毒性。并導(dǎo)致血磷和堿性磷酸酯酶活性下降。聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織早在1973年聯(lián)合召開的第三次食品添加劑和污染物會(huì)議上，就將單端孢霉烯族毒素定為最危險(xiǎn)的自然發(fā)生食品污染物。

檢測(cè)^[1]

1.薄層色譜法

薄層色譜法是最早建立的一種檢測(cè)方法。GB/T 5009.111-2003ll 谷物及其制品中嘔吐毒素的測(cè)定就采用了薄層色譜法，其檢測(cè)限為1 mg/kg。適用于谷物如小麥、玉米、大麥等及其制品如蛋糕、餅干、面包等中嘔吐毒素的測(cè)定。最低檢出限為20 ixg/kg-300 g/kg。操作簡(jiǎn)便，但是也有一些缺點(diǎn)，如靈敏度差，處理樣品時(shí)工作量大，且提取過程中需要使用大量的有機(jī)溶劑，適用于具有一定實(shí)驗(yàn)室條件的檢測(cè)，對(duì)于基層糧食企業(yè)還存在局限性。

2.試紙條/卡法

DON快速檢測(cè)膠體金法應(yīng)用膠體金比色技術(shù)免疫競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)原理，能夠快速檢測(cè)糧食及其加工制品中DON。主要有分為定性條法和定量條法。

1）定性條法糧食企業(yè)單位根據(jù)需要選擇如500、800、1000等限量的試紙條，通過結(jié)果的陰陽性判定樣品中DON是否在某一定量限內(nèi)。該方法價(jià)格低廉，操作簡(jiǎn)單快捷，對(duì)檢驗(yàn)人員的實(shí)驗(yàn)技能要求不高，不需要配備額外的儀器設(shè)備，在糧食收購(gòu)及入庫(kù)過程中的把關(guān)及檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)的前期大批量篩選中非常實(shí)用，是基層糧食企業(yè)的優(yōu)質(zhì)選擇。

2）定量條法定量條法同樣基于競(jìng)爭(zhēng)性免疫反應(yīng)原理進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)試紙條上檢測(cè)T線與質(zhì)控C線的顏色深淺與樣品中待檢測(cè)物的含量之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系，通過手持式試紙條掃描讀書儀讀出最終結(jié)果，該方法檢出限為250 g/kg，整個(gè)檢測(cè)過程不到10 min。

3. 試劑盒法

試劑盒法基于間接酶聯(lián)免疫原理，在酶標(biāo)板微孔上預(yù)包被DON抗原，樣本中的嘔吐毒素和微孔上預(yù)包被的抗原競(jìng)爭(zhēng)DON抗體(抗試劑)，同時(shí)嘔吐毒素抗體與酶標(biāo)二抗(酶標(biāo)物)相結(jié)合，經(jīng)TMB底物顯色，樣本吸光度值與其所含嘔吐毒素含量呈負(fù)相關(guān)，由此可知樣本中DON含量。檢出限為200 g/kg，適用于大量樣品的準(zhǔn)確、快速分析。

4.真菌毒素及重金屬快速檢測(cè)及監(jiān)測(cè)分析系統(tǒng)

真菌毒素及重金屬快速檢測(cè)及監(jiān)測(cè)分析系統(tǒng)也基于膠體金比色技術(shù)免疫競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)原理，除具備定量條法的所有優(yōu)點(diǎn)外，完善了快檢技術(shù)平臺(tái)，可實(shí)現(xiàn)檢測(cè)數(shù)據(jù)實(shí)時(shí)交互及在線檢測(cè)，還可同時(shí)檢測(cè)真菌毒素及重金屬鉛和鎘。試紙條無苛刻的儲(chǔ)存條件，實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)單快速，對(duì)檢驗(yàn)人員的技術(shù)要求低，試劑環(huán)保安全，實(shí)驗(yàn)殘余無污染。隨著對(duì)糧食安全的逐漸重視，快速檢測(cè)系統(tǒng)在糧食企業(yè)，尤其是基層糧食企業(yè)的應(yīng)用前景將十分廣闊。

5. 儀器法

1）氣相色譜法氣相色譜法檢測(cè)DON具有靈敏、高選擇性、準(zhǔn)確性和精確性等優(yōu)點(diǎn)，還可同時(shí)檢測(cè)單端孢霉烯族化合物及玉米赤霉烯酮等真菌毒素，但是變異系數(shù)大。早在1986年，AOAC就利用氣相色譜法檢測(cè)小麥中的DON含量，但氣相色譜法尚存在一系列問題，有待標(biāo)準(zhǔn)化。

氣相色譜法檢測(cè)DON需要進(jìn)行衍生化處理，實(shí)驗(yàn)繁瑣負(fù)責(zé)，儀器設(shè)備昂貴，多在研究性機(jī)構(gòu)或單位，在基層糧食企業(yè)的應(yīng)用還存在一定的局限，技術(shù)上存在的問題也在一定程度上限制了其在糧食行業(yè)的推廣應(yīng)用。

2）高效液相色譜法GB23503-200918中用提取液提取試樣中的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，經(jīng)免疫親和柱凈化后，用高效液相色譜紫外檢測(cè)器測(cè)定，外標(biāo)法定量。該方法檢測(cè)靈敏度高，操作步驟簡(jiǎn)單，不需要進(jìn)行衍生化反應(yīng)，逐漸代替了氣相色譜法，但高效液相色譜儀器設(shè)備成本高，用時(shí)長(zhǎng)，操作繁瑣，需要專門人員操作，一次檢測(cè)只能測(cè)定DON含量，不能同時(shí)檢測(cè)DON衍生物。串聯(lián)質(zhì)譜后可同解決這一問題。

6. 其他方法

有學(xué)者不斷嘗試將近紅外光譜及傅里葉轉(zhuǎn)換紅外光譜、熒光極性免疫等方法應(yīng)用于DON 的快速檢測(cè)分析。使用傅里葉轉(zhuǎn)換紅外光譜研究了DON含量在50 到16000~g/kg之間的樣品，建立了一種快速、靈敏、準(zhǔn)確的多路傅里葉轉(zhuǎn)換紅外光譜檢測(cè)方法。這些方法大大簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)步驟，縮短了分析時(shí)間，但還有待近一步探索完善并最標(biāo)準(zhǔn)化，離在糧食行業(yè)中的推廣應(yīng)用還有一段距離。

主要參考資料

[1] 盛林霞, 付豪, 吳藝影, 等. 糧食中嘔吐毒素檢測(cè)方法的研究進(jìn)展[J]. 糧食儲(chǔ)藏, 2018, 47(1): 32-36.

[2] 鮑淑青, 張克英, 陳海軍. 飼料中嘔吐毒素的危害與防治[J]. 中國(guó)飼料, 2007 (17): 34-36.

[3] 孫秀蘭, 邵景東, 王俊雙. 糧油食品中嘔吐毒素危害及風(fēng)險(xiǎn)分析[J]. 糧食與油脂, 2007 (3): 41-43.