酶聯(lián)免疫吸附實驗原理及分類

ELISA是最經(jīng)典的一種免疫學(xué)實驗操作，中文名字叫酶聯(lián)免疫吸附實驗。其原理就是利用抗體能和對應(yīng)的抗原蛋白分子特異結(jié)合，同時通過抗體上的酶聯(lián)標(biāo)記與底物反應(yīng)顯色或被激發(fā)而發(fā)光，最終間接完成抗原抗體復(fù)合物的觀察、檢測與定量。

ELISA原理

圖1 為elisa原理

其實elisa和westernblot很像，不同的是后者的待測物也就是蛋白質(zhì)，通常是在細胞內(nèi)，因此需要提取蛋白質(zhì)才能進一步分離和檢測；而elisa的待檢測物通常已經(jīng)從細胞內(nèi)分泌出來到培養(yǎng)液中，因此他的前處理步驟更簡單。

圖2 比色法蛋白質(zhì)印跡檢測示意圖

幾種不同的elisa方法對比

ELISA根據(jù)檢測方法分為好幾類，分別是直接法、間接法和夾心法。

直接法就是待檢測抗原黏附在微孔板的孔內(nèi)，然后使用帶酶標(biāo)的一抗與抗原結(jié)合，對吼加入底物進行顯色，并檢測吸光度，由于吸光度的大小與抗原抗體復(fù)合物的數(shù)量成一定的線性關(guān)系，也就間接的實現(xiàn)了測定抗原數(shù)量的目標(biāo)。

間接法和直接法的區(qū)別在于兩種抗體代替一種抗體，結(jié)合抗原的抗體（一抗）不帶酶標(biāo)記物，當(dāng)抗原抗體結(jié)合后再使用酶標(biāo)記的二抗結(jié)合一抗加入底物顯色并檢測。

在間接法的基礎(chǔ)上，又再發(fā)展出更為復(fù)雜的夾心法，它在微孔板底部預(yù)先包被一種捕獲抗體，用于結(jié)合抗原，在這個復(fù)合物的基礎(chǔ)上再結(jié)合一抗、二抗并檢測。

上述三種方法各有特點，目前來看夾心法的ELISA應(yīng)用最普遍，下面這個表格總結(jié)不同方法特點：

直接法

間接法、夾心法

優(yōu)點

操作簡單
不存在抗原和二抗發(fā)生交叉反應(yīng)導(dǎo)致的結(jié)果錯誤

二抗選擇面廣泛，制備也比較簡單，大大降低陳本

酶標(biāo)種類也有更多選擇，一抗無需考慮標(biāo)記酶標(biāo)信息，所以它在制備中可以盡可能保證免疫結(jié)合活性

檢測靈敏度大大提高，因為信號得到放大

缺點

檢測抗體制備比較困難且成本高，因為既要保證免疫活性還要標(biāo)記酶標(biāo)信息

檢測信號無法放大，信號較弱

潛在的二抗與目標(biāo)抗原發(fā)生反應(yīng)，造成信號錯亂風(fēng)險

更多操作步驟，反應(yīng)時間更長

接下來，我們繼續(xù)了解幾種比較特別的ELISA實驗法，首先是競爭法。如果待測抗原特別小，無法同時結(jié)合

捕獲抗體和一抗的話，就不適合用夾心法檢測，此時可以在微孔板孔內(nèi)包被抗體，同時提供帶標(biāo)記的同種抗原，把待測抗原和標(biāo)記抗原一起加入和抗體結(jié)合，由于兩者會競爭結(jié)合抗體，所以最終檢測的信號越高，證明待檢測抗原越少，反之則越多。

另一種比較特別的是叫elispot,用于檢測細胞分泌出來的蛋白和細胞因子。預(yù)先在孔內(nèi)包被捕獲抗體，加入未處理/預(yù)先處理的細胞，當(dāng)細胞分泌出特定蛋白或細胞因子時，就會被抗體捕獲。細胞裂解后孔內(nèi)只剩下細胞因子與捕獲抗體的復(fù)合物，此時再加入能結(jié)合的細胞因子的帶生物素標(biāo)記的抗體。最終通過顯色形成的斑點來計算分泌蛋白的數(shù)量。